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QiuYue,DuTianyu,WangYing,WangXiao,YangWenhui,HuLingfei,YinZhe,ZhouDongsheng,WangLi,ZhangYiquan
2020, 44(10): 0-0.
目的 研究副溶血弧菌密度感应系统核心调控子AphA和OpaR对exsA和exsD的调控机制。方法 提取野生株（WT）和调控子基因突变株（ΔaphA或ΔopaR）的总RNA，采用引物延伸实验研究exsA和exsD的转录起始位点，并根据WT和突变株中引物延伸产物的丰度，判定AphA和OpaR对exsA和exsD的调控关系；分别将exsA和exsD的启动子区克隆入pHRP309中β-半乳糖苷酶基因上游，构建LacZ重组质粒，并将重组质粒转入WT、ΔaphA和ΔopaR中，获得LacZ菌株，通过LacZ报告基因融合实验进一步研究AphA和OpaR对exsA和exsD的调控关系；PCR扩增exsA和exsD的上游调控序列，并表达纯化His-AphA和His-OpaR重组蛋白，利用凝胶阻滞实验（EMSA）研究重组蛋白是否可以结合到exsA和exsD的上游调控序列上，并采用DNase I足迹实验研究鉴定具体的结合位点。结果 引物延伸实验结果显示，exsA和exsD 分别各有一个转录起始位点，分别为C（-440）和C（-105）（翻译起始位点为+1），且低密度生长条件下，AphA激活它们的转录活性，而在高密度生长条件下，OpaR抑制它们的转录活性，随后的LacZ报告基因融合实验进一步确证了这种调控关系。体外的EMSA和DNase I足迹实验结果表明，His-AphA和His-OpaR均不能与exsA和exsD启动子DNA序列结合。结论 低密度生长时，AphA间接激活exsA和exsD的转录；高密度生长时，OpaR间接抑制exsA和exsD的转录。
