论著
张宇奇, 石慧, 庞博骅, 金蕊, 程龙, 牛畅, 田沈
目的 探究红细胞膜蛋白带4.9(EPB49)在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)感染中的作用及机制。方法 分别在H1299-ACE2和A549-ACE2细胞中转染EPB49siRNA或pCDH-EPB49-Myc,在上述细胞中感染SARS-CoV-2,验证敲低或过表达EPB49对SARS-CoV-2感染的影响。分别使用血管紧张素转化酶2(ACE2)阴性细胞H1299和A549构建EPB49过表达模型并感染SARS-CoV-2,检测感染水平差异,以此观察EPB49能否作为独立受体发挥调节作用。在H1299-ACE2和Caco-2细胞中构建EPB49过表达和敲低模型,检测EPB49对受体ACE2表达的影响。使用HEK293T细胞分别共转染表达SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)S-HA/S1-HA/S2-HA和EPB49-Myc的质粒,利用蛋白免疫共沉淀实验研究EPB49与S蛋白的相互作用。分别在H1299-ACE2和Caco-2细胞中敲低和过表达EPB49,与表达S-GFP的HEK239T共培养,检测EPB49对S-ACE2相互作用引起的膜融合的影响。使用mCherry慢病毒感染A549-ACE2细胞构建稳定表达红色荧光的细胞株,与表达S-GFP的HEK239T细胞组成双荧光融合报告系统重复实验,验证EPB49对细胞融合的影响。结果 过表达EPB49显著上调SARS-CoV-2的感染,但当受体ACE2不表达时,EPB49不能独立介导SARS-CoV-2的感染,并且EPB49过表达对受体ACE2无显著影响。蛋白免疫共沉淀实验结果显示,EPB49能够直接与S蛋白的S2亚基结合,过表达EPB49能够显著促进病毒-细胞膜的融合。结论 EPB49作为细胞内锚点与S2亚基直接结合,并通过调控病毒-细胞膜融合促进SARS-CoV-2的感染。