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军事医学

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    多标记免疫荧光技术在检测肝癌组织中GP73及肿瘤相关巨噬细胞的应用
    刘宁
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 检测肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中GP73，CD68，CD206的表达情况, 并探讨GP73与CD206的相关性及临床意义。方法 采用基于酪胺信号放大（TSA）技术的多标记免疫荧光染色方法在129例包含肝癌及其癌旁正常组织的组织芯片上同时区别标记GP73 ,CD68，CD206三种抗原及DAPI, 并使用自动MSI系统（Vectra，PerkinElmer，Waltham，MA）定量分析GP73与CD206表达的相关性，并判断与肿瘤预后的相关性。结果 肝癌组织CD206的表达含量与GP73水平呈正相关（P<0.001）；低表达GP73的肝癌患者生存率与GP73高表达的肝癌患者无统计学差异（P=0.8078），低表达CD206的肝癌患者生存率高于CD206高表达肝癌患者（P=0.0445）。结论 GP73含量与肿瘤相关巨噬细胞（Tumour-associated macrophages，TAMs）密度呈正相关，TAMs密度越高的肝癌患者生存率越低，利用多色荧光染色技术配合光谱成像技术和定量分析软件，为研究复杂肿瘤微环境提供了更高精度和更可靠的组织学数据，也为临床判断肿瘤预后提供新思路。
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    环肽化合物NW-G01的抗癌活性研究
    WangLili
    2018, 42(9): 0-0.
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    [摘要]目的 鉴定环肽化合物NW-G01对肿瘤细胞增殖与凋亡的调控作用。方法 显微拍照法检测细胞的形态变化，克隆形成试验检测肿瘤细胞的克隆形成能力，MTT技术检测细胞增殖情况，细胞流式术测定细胞死亡率。结果 显微拍照法和MTT技术检测结果表明NW-G01能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，其抑制效果具有时间依赖性和浓度依赖性。NW-G01对胃癌细胞SGC-7901细胞的克隆形成能力具有显著抑制作用，并能够降低细胞中S期细胞的比例，阻断细胞周期的进程。此外，流式细胞术检测结果表明NW-G01能够剂量依赖性的诱导SGC-7901细胞凋亡。结论 环肽化合物NW-G01能够抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞凋亡，在细胞水平具有显著的抗癌活性。
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    A型肉毒毒素鼠源中和单抗的制备与鉴定
    张秀娟
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 制备并鉴定A型肉毒毒素（BoNT/A）鼠源中和单抗。方法 利用BoNT/AHc抗原免疫小鼠筛选得到的55株杂交瘤细胞培养上清，通过小鼠中和实验选出中和活性较高单抗，进行抗体分型并扩增抗体可变区基因；利用BALB/c小鼠制备腹水，通过辛酸-硫酸铵以及Protein-G亲和层析纯化，并进行ELISA、SDS-PAGE、Western blot、截短实验、BIAcore及中和活性分析。结果 筛选得到一株中和活性较高的鼠单抗BAS51，其轻链为κ、重链为IgG1，获得轻、重链可变区序列；小鼠腹水效价为7.29×105，纯化抗体纯度大于95%；BAS51与抗原BoNT/AHC亲和力常数为1.53×109 L/mol，可与HCC片段结合，为线性表位，中和活性为100 LD50/mg。结论 得到1株具有较强中和活性的抗BoNT/A鼠源单抗，为A型肉毒毒素中和抗体的研发奠定了基础。
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    成纤维细胞生长因子FGF13A的亚细胞定位研究
    官磊
    2018, 42(9): 0-0.
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    【摘要】 目的 探究成纤维细胞生长因子FGF13A蛋白的亚细胞定位，并确定其核仁定位信号（NoLS）。方法 利用丙氨酸替换FGF13A蛋白中可能的核仁定位信号中的氨基酸，将各突变体与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达;各融合蛋白表达质粒转染人胚肾细胞系HEK-293细胞和人膀胱癌细胞系5637细胞；转染48h后通过激光共聚焦显微镜观察细胞内绿色荧光的分布确定融合蛋白的亚细胞定位。 结果 FGF13A-EGFP蛋白定位于细胞核仁，FGF13B-EGFP蛋白定位于胞质；FGF13A蛋白的N端62个氨基酸是其核仁定位的关键序列；FGF13A蛋白的55KKRRRRR61为其核仁定位信号的核心序列，将55KKRRRRR61突变为55AAAAAAA61后，FGF13A蛋白失去其核仁定位能力，而只突变其中单个（M1: 55KKARRRR61）或部分（M2: 55AARRRRR61; M3: 55KKAARRR61和M4: 55KKRRAAA61）氨基酸，并不影响FGF13A的核仁定位。 结论 成纤维细胞生长因子FGF13A定位于细胞核仁，其核仁定位信号位于蛋白N端，核心序列为55KKRRRRR61。这一发现为进一步研究FGF13A的生物学功能奠定了基础。
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    乳酸脱氢酶B基因的克隆及其活性分析
    刘刘
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的：构建带Flag标签的乳酸脱氢酶B（lactate dehydrogenase B, LDHB）基因的真核表达载体，鉴定LDHB表达产物的生物学活性。方法：采用PCR技术从人乳腺文库扩增LDHB基因，将其克隆到pCDH-EF1-MCS-T2A-puro载体中，酶切和测序验证后，转染人胚肾293T细胞，通过蛋白免疫印记鉴定其表达；转染人肝癌HepG2细胞，采用酶和底物反应的方法检测乳酸含量。结果：从人乳腺文库扩增得到的约1000 bp的cDNA片段克隆到pCDH-EF1-MCS-T2A-puro载体上，测序结果与目的序列完全一致；转染人胚肾293T细胞后，LDHB基因得以表达；乳酸含量测定结果显示，LDHB的表达促进了肝癌细胞乳酸的生成。结论：成功构建了pCDH-Flag-LDHB真核表达载体，表达的LDHB具有生物学活性，为进一步研究LDHB在缺氧和肿瘤发生发展中的功能奠定了良好基础。
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    IL10参与调控巨噬细胞的极化
    黄小会
    2018, 42(9): 0-0.
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    [摘要] 目的 研究IL-10在骨髓单个核细胞向巨噬细胞分化以及在巨噬细胞极化中的作用。方法 分离野生型及IL-10表达缺陷小鼠的骨髓单个核细胞，M-CSF诱导细胞分化为巨噬细胞。流式检测细胞的增殖、分化、凋亡以及LPS刺激后巨噬细胞的极化；细胞计数检测细胞数量；定量PCR检测细胞周期调控相关分子及炎性相关分子的表达。结果 骨髓单个核细胞诱导5-7天，流式结果显示，IL-10的表达缺陷不影响细胞向巨噬细胞的分化。虽然相比野生型，IL-10缺陷细胞数量略有增加，但差异不显著。流式结果及定量PCR结果进一步证明IL-10表达缺陷不影响细胞增殖和凋亡。IL-10缺陷细胞分化7天后CD86的表达显著高于野生型，LPS刺激后CD86表达均升高，但IL-10缺陷巨噬细胞的表达显著高于野生型。LPS 刺激6 h，IL-10缺陷巨噬细胞iNOS 和IL-18的表达水平显著高于野生型巨噬细胞。结论 IL-10不影响单个核细胞的增殖分化，但参与调控巨噬细胞的极化。
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    活/死菌检测方法的研究进展
    陈盟
    2018, 42(9): 0-0.
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    细菌活性检测在细菌生物学研究、消毒灭菌评价、卫生安全监测、食品卫生控制等科学领域具有重要意义。日常实验研究中多表现为活/死菌区分检测。检测方法通常基于细菌的可培养性、代谢活性以及细胞膜完整性这三个细菌活性评价标准。本文概述了当前常见的活/死菌检测方法的原理、特点及应用实例，并对比了各种检测方法的优缺点。
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    心肌缺血、缺氧大鼠模型的建立及琥珀酸受体表达的变化
    ZhangFangyuan
    2018, 42(9): 0-0.
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    [摘要] 目的 分别建立冠脉结扎心肌缺血、模拟高原环境缺氧大鼠模型，检测大鼠心肌组织琥珀酸（盐）受体（GPR91）表达的变化，以分析心肌缺血、缺氧与GPR91变化之间的关系。 方法 以SD大鼠为实验对象，分别建立冠脉结扎心肌缺血及模拟高原环境心肌缺氧动物模型。前者由结扎大鼠心脏左冠状动脉前降支诱发，包括对照组（假手术组）、左冠动脉结扎12 h组和24 h组，每组动物6只，通过比较大鼠心电图、心肌组织TTC染色、血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）以及心肌肌钙蛋白1（cTn-1）的含量变化，对所建模型加以确认；后者利用专用低气压舱模拟高原低氧环境诱发，实验包括正常气压组（control组）、低气压环境生存1 d、3 d、5 d和7 d组，每组动物6只，并检测大鼠血清中LDH、CK及cTn-1含量的变化。针对上述两种模型的各组动物，分别以实时荧光定量PCR法、Western Bolt法检测大鼠心肌组织GPR91在mRNA、蛋白的表达水平。 结果 在冠脉结扎心肌缺血模型大鼠中，与对照组比较可见：结扎12 h和24 h组心电图表现为ST段弓背型抬高；心脏梗死面积比例分别为23.18±3.46及34.85±2.22（P<0.05）；结扎12 h组动物血清中LDH、CK的含量呈现增加趋势，cTn-1的增加最为明显（P<0.05），结扎24 h组动物的LDH、cTn-1均明显增加（P<0.05）。在模拟高原环境心肌缺氧模型中，与control组比较可见：低气压环境生存3 d、5 d和7 d组动物血清LDH、CK及cTn-1的含量均明显增加（P<0.05），低气压环境生存1 d动物的变化较小。就GPR91 mRNA及蛋白表达水平而言，上述心肌缺血、缺氧各组大鼠均较对照组出现了明显的上调（P<0.05）。 结论 通过心脏冠脉结扎、低气压生存环境可分别诱发大鼠心肌缺血、缺氧模型；在缺血、缺氧过程中，大鼠心肌组织GPR91在mRNA及蛋白的表达水平均呈现明显上调变化，说明心肌缺血、缺氧与GPR91的变化相关联，预示着后者可作为心肌缺血、缺氧防治靶点的潜在可能性。 [关键词]：心肌；缺血；缺氧；GPR91；大鼠
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    基于转录组大数据的抗辐射损伤化合物筛选
    刘祯
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 利用Library of Integrated Network-based Cellular Signatures ( LINCS）计划的小分子化合物扰动不同细胞系的转录谱数据，结合辐射损伤的转录谱特征，寻找具有抗辐射损伤功能的化合物，并推荐这些化合物在特定细胞系上的实验剂量。方法 经过一系列数据处理步骤，构建了30722个小分子扰动的转录反应表达谱数据集，以及反映细胞辐射损伤特征的转录谱特征集。计算小分子化合物扰动的转录谱在辐射损伤特征集上的富集分数及P值，按照一定的筛选规则，得到具有辐射损伤防治效果的化合物列表，并依据一定规则获取这些化合物在特定细胞系上的最佳细胞实验剂量。结果 建立了一套基于转录组数据的筛选抗辐射损伤化合物的筛选方法，经过筛选获得有潜在抗辐射损伤作用的287个小分子化合物，经文献调研发现14个已经报道具有抗辐射损伤功能，雌激素类化合物在筛选结果中显著富集。结论 基于转录组大数据的筛选方法能有效的缩小抗辐射损伤化合物的实验范围，提高辐射损伤药物的发现速度。该方法基于公开数据，不需要进行湿实验，具有成本低，速度快的优势，另外该方法具有开放性，可进一步增加数据，扩大筛选范围和筛选质量。
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    基于蒙特卡洛模拟的肺癌患者体内光子能谱和散射次级电子能谱研究
    谢奇山,撒昱
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 放射治疗是一种重要的恶性肿瘤治疗手段，近年来放射治疗技术有了很大的进步，放射治疗的精准度越来越高。放射治疗将会针对患者的个体化特征设计更精准的个体化放射治疗方案。为给放射生物剂量个体化计算奠定理论基础，本文对放射治疗中高能光子束进入到患者肿瘤及正常组织后光子能谱和散射次级电子能谱规律进行了研究。方法 首先将患者的CT图像序列经重采样后体元尺寸为2.54*2.54*2.5mm3并将体元的CT值转换成材料的电子密度。然后基于蒙特卡洛模拟计算各个受照射体元的光子能谱和散射次级电子能谱,并分析能谱规律。结果 光子能谱具有很好的一致性，能谱在250-300keV之间达到峰值，平均能量范围约为900-1150keV。散射次级电子能谱与组织密度相关，在高密度区域(肿瘤组织)散射次级电子平均能量较高(平均能量约为909.58keV)且能谱存在展宽,低密度区域散射次级电子平均能量较低(平均能量为536keV)且能谱无展宽。结论 本研究给出了肺癌患者体内光子能谱和散射次级电子能谱的具体分布规律和表达，为在细胞及DNA层面研究放射生物剂量计算模型奠定了基础。
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    IL-6通过JAK2/STAT3信号通路促进CD133-肺腺癌细胞（A549）获得干性特征
    张曼泽
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 研究IL-6在成体肺腺癌A549细胞（CD133- 细胞）干性转变中的作用及其机制。方法 CD133磁珠抗体分选成体A549细胞后，分别用浓度为0 (Control) 、10、20、40 ng/ml的IL-6刺激24 h，采用克隆球形成实验检测细胞克隆球形成能力，通过Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力，免疫印迹检测SOX2、磷酸化JAK2（p-JAK2）和磷酸化STAT3（p-STAT3）水平。结果 IL-6刺激可显著增加CD133-细胞的克隆球形成、迁移和SOX2的表达水平，且呈一定剂量依赖性。进一步研究发现IL-6可显著上调磷酸化JAK2（p-JAK2）的表达，且呈剂量依赖性，IL-6刺激还可显著增加磷酸化STAT3的表达，但是其表达峰值出现在20 ng/ml组，40 ng/ml IL-6刺激时，其表达水平虽显著高于对照组，但低于10 ng/ml组和20 ng/ml组，这与SOX2的变化趋势一致。最后，加入JAK2激酶抑制剂AG490后，IL-6诱导的STAT3磷酸化和SOX2表达升高被显著抑制。结论 在体外，IL-6可通过调节JAK2/STAT3信号通路促进CD133-肺腺癌细胞获得干性特征。
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    基于LoxP-Cre系统的Ronin基因造血系统条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定
    李秀,高慧英,杨小玉,刘超,赵珂,詹轶群,杨晓明,李长燕
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 建立Ronin基因造血系统条件性敲除的小鼠模型。方法 基于LoxP-Cre系统设计基因敲除策略，获得Roninflox/+（flanked by loxP）小鼠，与Vav-iCre+/-小鼠交配繁殖得到Roninflox/+ Vav-iCre+小鼠，与Roninflox/+小鼠交配获得Roninflox/flox小鼠，将Roninflox/+ Vav-iCre+小鼠与Roninflox/flox小鼠交配以获得Roninflox/flox Vav-iCre+小鼠。提取鼠尾组织DNA，通过PCR扩增后鉴定基因型，提取小鼠造血相关组织蛋白，通过Western blot检测Ronin的表达情况。结果 Roninflox/+ Vav-iCre+小鼠与Roninflox/flox小鼠交配所得子代共51只小鼠中，Roninflox/flox Vav-iCre+基因型小鼠仅1只，实际出生数量远低于理论值，且出生小鼠一周内死亡。Roninflox/+ Vav-iCre+基因型小鼠可正常存活，其造血相关组织中Ronin表达低于野生型小鼠。结论 本研究构建的造血系统特异缺失Ronin基因的小鼠，为研究Ronin在早期造血调控发挥的作用提供了动物模型。
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    去泛素化酶OTUB1影响p97/NPL4复合体形成调控肿瘤发生
    王艳双
    2018, 42(9): 0-0.
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    摘要] ] 的 目的 探讨去泛素化酶 OTUB1 调控 p97 参与肿瘤发生的机制。法 方法 通过 TCGA 数据库分析去泛素化酶 OTUB1 在肿瘤中表达情况，为了鉴定 OTUB1潜在的新的底物及其与肿瘤的关系，通过调研参考文献中蛋白质谱鉴定数据库的方法发现 OTUB1/OTUB2 与 p97 可相互作用，用 Co-IP 方法检测 OTUB1/OTUB2与p97相互作用,在细胞体内过表达和敲低OTUB1检测P97的蛋白水平以及泛素化水平，用免疫荧光方法检测 OTUB1 与 P97 共定位，检测 OTUB1 对 NPL4 和P97 复合体形成的影响，MTT 实验检测 OTUB1 敲低后细胞生长能力及对 p97 抑制剂的应答情况。果 结果 前期通过 TCGA 数据库分析去泛素化酶在肿瘤中的关系发现 OTUB1 在多种肿瘤中异常表达，为了探索 OTUB1 在肿瘤中异常表达的机制，以及鉴定潜在的新的底物，通过文献调研已有蛋白质谱鉴定数据库发现OTUB1/OTUB2 与 p97 可相互作用，用免疫共沉淀（Co-IP）的方法发现 OTUB1与 p97 有相互作用，在细胞中过表达 OTUB1 发现，IP p97 其泛素化水平下调，且过表达 OTUB1 活性缺失突变体不能降低 p97 泛素化水平，同时敲低 OTUB1，IP p97 发现其泛素化水平上调。随后，紧接着敲低和过表达 OTUB1/2 发现 p97蛋白水平不受调控，说明该泛素化调控不是 K48 泛素类型。p97 可与 NPL4 形成复合体发挥促癌作用，随后检测了 p97 和 NPL4 复合体在 OTUB1 敲低细胞里形成情况，结果显示 OTUB1 敲低，p97 和 NPL4 相互作用减弱。这很可能是潜在的机制，即 OTUB1 影响 P97 与 NPL4 复合体的形成调控肿瘤发生。 结论 OTUB1可以与 P97 相互作用并调控 p97 的泛素化水平，并影响 p97 和 NPL4 复合体的形成从而调控肿瘤发生。
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    MLN4924与5-氟尿嘧啶协同杀伤人结肠癌HCT116细胞的研究
    时慧森慧森
    2018, 42(9): 0-0.
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    目的 探讨MLN4924与5-氟尿嘧啶（5-Fu）单独及联用对人结肠癌HCT116细胞活力的影响及其发挥作用的可能途径。方法 细胞活力实验检测两药单独及联用对HCT116细胞活力的影响；应用中效原理计算两药联合应用的联合指数，判断药物联用的效果；将HCT116细胞分为对照组、MLN4924组、5-Fu组及联合组，药物作用后，流式 Annexin V-FITC/PI双标法检测各组细胞凋亡情况；蛋白印迹实验检测各组细胞Cleaved PARP、Cleaved caspase3的表达水平。结果 随着MLN4924和5-Fu浓度的增加，HCT116细胞活力逐渐降低；MLN4924与5-Fu联用时，抑制效果明显强于单药作用（P＜0.001），各联合用药组的联合指数均小于1，提示两药联用起协同效果；与对照组相比，单药及联合用药均可显著地促进HCT116细胞的凋亡(P＜0.001)，且联合用药效果显著优于单独用药(P＜0.01)；与流式 Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡的结果相一致，联合组Cleaved PARP、Cleaved caspase3蛋白表达较对照组及单药组明显升高。结论 MLN4924与5-Fu通过促进细胞的凋亡而发挥协同抑制人结肠癌HCT116细胞的活力。
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    卫生士官战现场急救院校训练评价指标体系设计
    DengBochao
    2018, 42(9): 0-0.
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    [摘要] 目的 设计构建卫生士官战现场急救院校训练评价指标体系，为战救训练提供理论指导及评价方法。方法 首先通过文献调研、系统分析及专家访谈等方法，将训练工作从体制、要素、管理及条件等方面进行分解，初步构建三级评价指标体系。而后运用德尔菲专家咨询法对评价的指标进行进一步筛选和确定。最后运用层次分析法确定各级指标权重。结果 最终形成了卫生士官战现场急救院校训练评价指标体系，确定了各级指标的权重系数。结论 构建卫生士官战现场急救院校训练评价指标体系，对于准备把握训练进程，有效提升训练水平具有积极的推动作用。
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