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• 2024年, 第48卷, 第6期
  刊出日期：2024-06-25

    

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  论著

  长期高海拔暴露下焦虑、抑郁及失眠的网络分析

  范豪杰, 蔡珂而, 邓浩伟, 侯月皎, 成祥, 朱玲玲, 范明, 王笃明, 赵永岐

  2024, 48(6): 401-406. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.001

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  目的 探究长时间旅居高原人群的焦虑、抑郁及睡眠网络结构。方法 选择303名连续驻留高原时间超过6个月以上者,使用睡眠失眠严重指数量表（ISI）、患者健康问卷（PHQ-9）、广泛性焦虑障碍量表（GAD-7）等工具对其失眠、抑郁、焦虑进行评估,并应用网络分析方法分析以上症状组成网络的中心节点和桥状节点。结果 抑郁、焦虑、失眠3种症状中度以上检出率分别为38.9%（95%置信区间：33.4%~44.5%）、23.1%（95%置信区间：18.3%~27.9%）、18.5%（95%置信区间：14.1%~22.9%）。在抑郁-焦虑-失眠的心理网络中,ISI6“他人眼中睡眠对生活质量影响”为最中心的节点,其次是ISI2“睡眠维持困难”、GAD2“无法控制担忧”、GAD5“无法静坐”、PHQ3“睡眠问题”。在抑郁-焦虑-失眠的桥状心理网络中,5个桥状节点分别为：PHQ2“心情低落沮丧”、PHQ3“睡眠问题”、GAD5“无法静坐”、GAD7“害怕”、GAD4“难以放松”。结论 无论是整个网络的中心节点还是桥状节点,与睡眠相关的症状在整个网络结构中都有着重要的作用,“心情低落沮丧”作为桥状节点,对于焦虑-抑郁的共病网络有着重要的作用。对这些关键症状进行干预和防治可能对长期驻留高海拔人群的心理状态有所改善。
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  论著

  裸盖菇素对小鼠社交行为调控作用研究

  雷鑫, 李燊, 王禹霏, 夏文龙, 吴燕, 赵哲, 吴海涛

  2024, 48(6): 407-413. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.002

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  目的 评价裸盖菇素对C57BL/6J雄性小鼠社交行为的调控作用。方法 成年雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射低、中、高剂量裸盖菇素（0.2、1和5 mg/kg,i.p.）,采用三箱亲社会行为评价裸盖菇素对社交能力的影响。对经历慢性社会挫败（CSDS）的焦虑模型小鼠急性腹腔注射中剂量裸盖菇素（1 mg/kg）,采用改良型两箱社交行为学评价小鼠社交新颖性偏好行为的改变。结果 在亲社会行为学实验中,腹腔注射中剂量裸盖菇素（1 mg/kg）促进小鼠亲社会行为,延长社交时间（P<0.01）,腹腔注射低剂量裸盖菇素（0.2 mg/kg）对小鼠亲社会行为时间无明显影响,腹腔注射裸盖菇素（5 mg/kg）对小鼠亲社会行为表现出先抑制后促进作用。进一步研究发现,腹腔注射裸盖菇素（1 mg/kg）可增加经历慢性社会挫败应激模型小鼠社交新颖性探索时间。结论 1 mg/kg剂量裸盖菇素可促进小鼠产生亲社会效应,对慢性社会挫败应激小鼠的社交新颖性偏好行为缺陷具有潜在改善作用。
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  论著

  磷脂酶A2-重活化剂复合物治疗有机磷中枢中毒的研究

  曹文缤, 王淋, 隋昕, 骆媛, 杨军, 王永安

  2024, 48(6): 414-420. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.003

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  目的 利用磷脂酶A2（PLA2）开放血脑屏障（BBB）的特性,促使抗毒药物酰胺磷定（HI-6）进入中枢起效,为治疗中枢神经系统中毒提供新的研究思路。方法 通过体外释放和体外稳定性实验等方法,对复合物（PLA2+HI-6）的组分进行物理性质表征。利用荧光素钠模拟水溶性药物进行荧光染色,通过评价脑组织荧光病理,定性考察复合物的中枢递送能力。通过激光共聚焦显微镜下碘化丙啶染色,定性观察PLA2对细胞膜通透性的影响。通过建立梭曼染毒小鼠模型,评价复合物对抗有机磷中枢中毒效果：（1）测定小鼠脑乙酰胆碱酯酶重活化率;（2）观察小鼠脑组织病理切片;（3）统计不同处理组小鼠生存时间。分别从细胞水平和动物水平评价PLA2的安全性。结果 体外释放和体外稳定性实验结果表明,加入PLA2并不影响HI-6的释放和降解。在动物水平,PLA2有助于荧光素钠进入脑组织被细胞摄取,表现出良好的中枢递送能力。PLA2与HI-6药物组合将染毒小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的重活化率提升至50%,相比于单独给药HI-6,提高约12倍。小鼠脑组织病理结果显示,复合物能有效对抗神经毒剂中毒引起的中枢神经系统损伤,并在3倍染毒致死剂量下显著延长小鼠存活时间,同时明显缓解中枢中毒症状。递送机制研究发现,复合物通过增加细胞膜通透性,经跨细胞途径实现中枢递送。细胞水平和动物水平的安全性实验表明,PLA2在该研究中的使用剂量安全可靠,未造成不良反应。结论 该研究以PLA2为开放材料和小分子药物HI-6组合,成功构建一种能够有效穿透BBB的复合物PLA2-HI-6。该复合物具备一定中枢靶向性,能显著提高神经毒剂中毒后脑中乙酰胆碱酯酶重活化率,为解决有机磷中枢中毒救治难题提供了参考。
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  论著

  基于CRISPR/Cas9系统构建重组人丁酰胆碱酯酶定向整合的山羊胎儿成纤维细胞株

  毋云鹏, 邱业峰, 唐玉玲, 孙天奇, 秦佟童, 张睿, 法云智

  2024, 48(6): 421-428. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.004

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  目的 利用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复机制构建重组人丁酰胆碱酯酶（rhBChE）基因敲入山羊胎儿成纤维细胞株（GFF）,为后续制备表达rhBChE的山羊提供细胞株。方法 针对山羊β-酪蛋白（CSN2）基因设计并筛选有效sgRNA靶点,通过电转染、流式分选和PCR产物测序,在山羊乳腺上皮细胞（GMEC）中确认CSN2基因有效sgRNA;构建靶向有效靶点的红色荧光报告基因同源修复载体（P2A-mCherry）,利用流式细胞术检测该靶点的定向整合及表达效率;构建靶向山羊胎儿成纤维细胞CSN2基因有效靶点的rhBChE同源修复载体（P2A-rhBChE）,通过电转染和流式分选rhBChE阳性细胞克隆,经PCR产物测序鉴定rhBChE定向整合的阳性细胞株。结果 确定sgRNA4为山羊CSN2基因的有效靶点,该靶点可用于目的基因的定向整合;成功构建3株rhBChE定向整合的阳性细胞株。结论 靶向山羊CSN2基因的rhBChE阳性细胞株可为应用体细胞克隆技术制备乳腺表达rhBChE的山羊奠定基础。
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  论著

  舌下腺黏液性腺泡细胞特异性Cre重组酶基因敲入小鼠的建立和鉴定

  彭艳丽, 粟柯糙, 郎依铭, 谢中良, 李明月, 周学涛, 王庆业, 汪海珍, 杨晓, 杨冠, 滕艳

  2024, 48(6): 429-433. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.005

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  目的 建立和鉴定整合素β样蛋白1基因（Itgbl1）启动子指导下的Cre重组酶基因敲入小鼠。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研制Itgbl1-Cre基因敲入小鼠。利用Itgbl1-Cre基因敲入小鼠与Cre的报道小鼠ROSA^LSL-tdTomato交配的子代小鼠进行遗传细胞谱系示踪。通过红色荧光蛋白tdTomato鉴定Itgbl1阳性细胞及其子代细胞的组织表达谱。通过多色免疫荧光染色利用多种细胞特异性的标志物鉴定阳性细胞及其子代细胞的细胞类型。结果与结论 tdTomato蛋白在舌下腺的黏液性腺泡细胞、胰岛细胞和胃的分泌细胞中特异性表达。此外,tdTomato在部分视网膜和脑的神经元细胞以及少量肠的浆膜层、骨关节软骨、骨膜和骨髓的细胞中表达。成功建立了首个在小鼠舌下腺的黏液性腺泡细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠品系。
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  论著

  DNA损伤检查点蛋白调节子1通过抑制p53通路促进胆管癌细胞的增殖、迁移及侵袭

  刘梦玉, 刘信燚, 曾涛, 陈顺琦, 李元丰, 周钢桥

  2024, 48(6): 434-444. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.006

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  目的 探索DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）对胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭、周期以及凋亡的影响及其机制。方法 采用特异性靶向MDC1的小干扰RNA（siRNA）在胆管癌细胞RBE和Huh28中瞬时敲低MDC1,使用pLVX-HA-MDC1质粒在RBE和Huh28中瞬时过表达MDC1;采用实时定量PCR（qPCR）和Western印迹鉴定敲低和过表达MDC1的效果。采用CCK-8、平板细胞克隆形成、Transwell和Invasion实验分别检测RBE和Huh28细胞的增殖、迁移和侵袭能力;采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡;使用基因集富集分析（GSEA）预测与MDC1显著相关的信号通路,通过Western印迹验证通路相关节点分子的表达情况。采用免疫共沉淀（Co-IP）验证MDC1与p53的相互作用。采用流式细胞术和Western印迹验证MDC1是否通过p53通路影响RBE和Huh28的周期和凋亡。基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析胆管癌癌组织与正常组织中MDC1的mRNA表达差异情况,以及MDC1表达水平与胆管癌患者总体生存率的相关性。结果 敲低MDC1,RBE和Huh28细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著降低,S期细胞比例显著减少,G₀/G₁期细胞比例、凋亡率显著增加;而过表达MDC1,RBE和Huh28细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著提高,S期细胞比例显著增多,G₀/G₁期细胞比例、凋亡率显著减少;在RBE和Huh28细胞中,证实MDC1与p53存在相互作用,且MDC1显著下调p53、p-p53（Ser-15）及p53通路下游分子B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（BAX）、p53上调凋亡调控因子（PUMA）、p21的表达,显著上调B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）的表达,从而促进胆管癌细胞的发生发展;MDC1在胆管癌组织中的表达水平显著高于正常胆管组织,且MDC1高表达与胆管癌患者预后不良密切相关。结论 MDC1通过抑制p53通路促进胆管癌的发生发展,MDC1可作为新的胆管癌预后不良的标志物。
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  论著

  铁超载对小鼠肝脏原代细胞凋亡的影响

  苏贤, 王博, 李东东, 王蕾, 祁凤英, 付秋霞, 阎少多

  2024, 48(6): 445-452. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.007

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  目的 建立稳定的小鼠肝脏原代细胞同步分离技术,研究铁超载对肝脏原代细胞凋亡的影响。方法 通过胶原酶消化、percoll密度梯度离心和CD146磁珠分选等步骤,同步分离纯化小鼠肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞,并使用流式细胞术、免疫荧光染色等鉴定细胞类型。体外培养各类型细胞,使用0、25、50、100 μmol/L的柠檬酸铁铵刺激24 h建立铁超载模型,通过普鲁士蓝染色观察细胞铁含量,流式细胞术测定细胞存活率和线粒体膜电位水平。结果 肝脏原代细胞同步分离技术效率稳定,肝实质细胞得率为（4.0±0.5）×10⁷细胞/只,存活率为（76.33±0.67）%;肝窦内皮细胞得率为（5.0±1.0）×10⁶细胞/只,存活率和纯度分别为（93.63±0.25）%和（93.40±0.46）%;枯否细胞得率为（1.5±0.5）×10⁶细胞/只,存活率和纯度分别为（98.33±0.12）%和（88.30±2.02）%。获得的细胞数量多、活力好、纯度高,能满足后续实验要求。与空白对照组相比,柠檬酸铁铵处理的3种类型细胞中铁含量显著增加。在柠檬酸铁铵的刺激下,肝实质细胞的存活率从（73.97±5.54）%下降至（54.10±1.68）%,JC-1聚合物平均荧光强度从326.33±30.37下降至155.00±6.56,JC-1单体平均荧光强度从1700.00±144.04上升至3713.33±81.82;肝窦内皮细胞的存活率从（90.60±1.74）%下降至（78.03±2.15）%,JC-1聚合物平均荧光强度从502.33±5.51下降至372.33±4.04,JC-1单体平均荧光强度从750.00±67.51上升至1340.00±36.39;枯否细胞的存活率从（94.23±1.44）%下降至（88.37±1.56）%,JC-1聚合物平均荧光强度从652.67±25.66下降至478.00±12.49,JC-1单体平均荧光强度从1984.33±80.65上升至3062.33±245.20。结论 建立了稳定的小鼠肝脏原代细胞同步分离技术,并证实铁超载可增加肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞的凋亡。
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  论著

  新型冠状病毒PLpro负调控DDX3诱导的β干扰素抗病毒免疫通路

  王明宇, 陈晓娟, 孟欢, 邵丽婷, 焦园园, 李文倩, 李萍, 邢雅玲

  2024, 48(6): 453-460. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.008

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  目的 发现严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）木瓜样蛋白酶（PLpro）的宿主互作分子,探索其生物学意义。方法 邻近蛋白标记结合质谱分析筛选宿主互作分子DEAD-box解旋酶3（DDX3）;免疫荧光法分析PLpro与DDX3的胞内共定位;免疫共沉淀法分析PLpro与DDX3的相互作用,以及PLpro对DDX3与IκB激酶ε（IKKε）和TANK结合激酶1（TBK1）、DDX3与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）互作的影响;荧光素酶报告基因法检测PLpro对β干扰素（IFN-β）通路的影响和对底物的酶切效率。结果 DDX3能够与PLpro发生细胞内共定位和相互作用;PLpro可能抑制DDX3-MAVS复合体形成,抑制DDX3-IKKε-TBK1之间的相互作用,负调控Ⅰ型干扰素通路;DDX3过表达情况下,PLpro/PLP-TM对底物位点的切割效率显著升高,而DDX3表达降低时,切割效率则显著降低。结论 DDX3可能是PLpro的宿主相互作用分子之一;PLpro负调控DDX3活化的IFN-β表达,为病毒复制提供有利的免疫环境,提升蛋白酶切割活性,共同促进病毒复制。
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  四烯甲萘醌促进CD8⁺ T细胞激活和抗肿瘤效应

  王佳荣, 梁丽云, 樊思淼, 张学敏, 李慧艳, 胡怀斌, 宋增庆

  2024, 48(6): 461-467. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.009

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  目的 探究四烯甲萘醌（MK4）对CD8⁺ T细胞激活和抗肿瘤效应的影响。方法 构建小鼠原代CD8⁺ T细胞体外培养与激活体系,通过磁珠法分选脾脏中CD8⁺ T细胞,将细胞置于提前包被CD3/CD28抗体的96孔板中激活培养。流式细胞术检测CD8⁺ T细胞激活受体及效应因子表达情况,并通过酶联免疫吸附实验检测培养上清中效应因子含量,评估MK4对CD8⁺ T细胞激活及产生细胞因子的影响;将CD8⁺ T细胞与小鼠结直肠癌MC38细胞按不同比例共培养进行体外杀伤实验,通过检测肿瘤细胞凋亡情况评估MK4对CD8⁺ T细胞杀伤肿瘤细胞能力的影响。结果 通过磁珠分选可得到高纯度的小鼠原代CD8⁺ T细胞（97.5%）,CD8⁺ T细胞可被包被的CD3/CD28抗体激活并增殖。与对照组相比,CD8⁺ T细胞经MK4处理后,细胞表面激活受体CD25、CD69、CD44表达升高,效应因子白细胞介素-2、γ干扰素、肿瘤坏死因子α、颗粒酶B产生和分泌水平更高。此外,与对照组相比（29.1%）,MK4处理组CD8⁺ T细胞诱导肿瘤细胞凋亡比例更高（36.7%）。结论 MK4可促进CD8⁺ T细胞激活及其杀伤肿瘤细胞的功能。
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  论著

  内源代谢物烟酰胺缓解小鼠自发性狼疮肾炎的症状

  申彦彦, 刘艳红, 韩秋影, 李爱玲, 夏晴, 张学敏, 张维娜

  2024, 48(6): 468-473. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.010

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  目的 构建系统性红斑狼疮疾病NZB/W（F1）小鼠模型,评价内源代谢小分子烟酰胺对NZB/W（F1）模型小鼠狼疮肾炎发病过程中各指标的影响,为烟酰胺在狼疮肾炎治疗中的作用提供依据。方法 通过雄性NZW小鼠与雌性NZB小鼠杂交获取雌性NZB/W（F1）小鼠,利用代谢笼收集小鼠24 h尿液样本并利用蛋白尿试纸检测小鼠蛋白尿水平;通过眼眶静脉丛获取小鼠血液样本,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中双链DNA抗体水平;利用全自动生化分析仪检测血清中血肌酐、尿素氮水平以及肝功能指标;通过苏木精-伊红染色和组织免疫荧光技术检测小鼠肾脏病理状态。结果 雌性NZB/W（F1）小鼠在自然发病过程中蛋白尿水平逐渐升高,血清中双链DNA抗体、血肌酐和尿素氮水平随周龄逐步升高,显示NZB/W（F1）小鼠狼疮肾炎疾病模型构建成功。与对照组同周龄小鼠相比,烟酰胺饲喂能够明显缓解小鼠蛋白尿水平（P=0.0070）,抑制血清中双链DNA抗体产生（P=0.0325）,缓解血肌酐（P=0.0067）和尿素氮（P=0.0166）指标发展,同时烟酰胺饲喂组小鼠肾脏损伤较对照组明显减轻。结论 成功构建NZB/W（F1）狼疮肾炎小鼠模型,发现烟酰胺饲喂能够明显缓解NZB/W（F1）小鼠狼疮肾炎的疾病进展。
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  综述

  CRISPR-Cas12a在食源性致病菌检测中的应用研究进展

  兰紫舒, 陈天姣, 李君文, 金敏, 杨栋

  2024, 48(6): 474-480. https://doi.org/10.7644/j.issn.1674-9960.2024.06.011

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  食源性致病菌是影响食品安全的重要因素,部队官兵在军事行动和日常军事生活中也面临着感染风险,迫切需要高效灵敏的快速检测技术。近年随着规律成簇间隔短回文重复序列 （CRISPR）技术的发展,具有反式切割活性的 CRISPR-Cas 体系越来越受到关注。该文系统阐述了基于CRISPR-Cas12a检测技术的基本原理和常规信号读出技术,对其在食源性致病菌检测中的应用现状和发展趋势进行了综述,讨论了面临挑战和未来发展趋势。