论著
吴文俊, 赵海鑫, 高俊, 王凯, 韩秋影, 李腾, 潘欣
目的 建立实时动态监测胞浆三磷酸腺苷(ATP)和线粒体ATP水平的模型,以研究代谢过程中能量的变化。方法 构建胞浆化学遗传学性质的绿色荧光蛋白(GFP)ATP探针(Chemo-G)和线粒体定位的化学遗传学性质的绿色荧光蛋白ATP探针(mito-Chemo-G)慢病毒质粒,并将辅助质粒与Chemo-G及mito-Chemo-G的慢病毒质粒共同转染至HEK293T细胞中,得到Chemo-G和mito-Chemo-G慢病毒。随后使用慢病毒感染HeLa细胞株。通过嘌呤霉素筛选、流式细胞分选等方法,获得稳定表达Chemo-G和mito-Chemo-G的HeLa细胞株。观察HeLa细胞的生长状态和GFP表达水平。使用活细胞成像系统对细胞进行连续拍摄,并在特定时间点加入刺激物以改变细胞内代谢状态,观察ATP探针的荧光强度变化。结果 成功构建含Chemo-G和mito-Chemo-G序列的慢病毒质粒;获得稳定表达Chemo-G及mito-Chemo-G的HeLa-Chemo-G和HeLa-mito-Chemo-G细胞系。所构建的细胞系生长状态良好,细胞内荧光定位准确。活细胞成像系统观察结果显示,HeLa-Chemo-G在加入2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)后,荧光共振能量转移(FRET)/GFP比值下降,加入葡萄糖后该比值部分逆转;HeLa-mito-Chemo-G细胞在加入组胺刺激后,FRET/GFP比值上升,而加入寡霉素后迅速降低。结论 成功构建了含Chemo-G和mito-Chemo-G序列的慢病毒载体,并建立了HeLa-Chemo-G和HeLa-mito-Chemo-G稳定转染细胞系,为研究细胞代谢及细胞内ATP水平变化提供了可靠的实验模型。